Icke-invasiva studier av proteiners dynamiska distribuering och interaktioner inne i levande celler


Project leader


Funding source

Swedish Research Council - Vetenskapsrådet (VR)


Project Details

Start date: 01/01/2007
End date: 31/12/2009
Funding: 1800000 SEK


Description

Upptäckten och utvecklingen av speciella proteinmarkörer (som GFP, "Green Fluorescent Protein", som numera går att få i nästan alla färgnyanser) i kombination med förfining av fluorescens mikroskopiska instrument har gjort det möjligt att studera proteiners dynamiska rörelser och associationer till olika strukturer inne i levande celler. Resultaten har revolutionerat hela vårt synsätt på den levande cellens funktion. Det föreslagna projektet syftar till att fortsätta utvecklingen av nya tekniker för kvantitativa studier av dynamisk proteintrafik och interaktioner mellan proteiner inuti levande celler. Våra studier fokuseras kring undersökningar av global omorganisering av cellen arvsmassa (kromatin) vid förändrat genuttryck samt kring kvantitativa analyser av proteiners interaktioner under fysiologiska förhållanden. En del av våra undersökningar förväntas bidra till förståelsen av epigenetisk (ej inprogrammerad i DNA sekvensen) kontroll av cellens genuttryck. Det har länge varit känt att en gens uttrycksnivå är starkt beroende av dess rumsliga position i cellkärnan. Traditionellt har det ansetts att aktiva gener med högt uttryck lokaliserar till ickekondenserat s.k. "eukromatin" i cellkärnans inre medan "tysta" inaktiva gener lokaliserar till kondenserat s.k. "heterokromatin" i cellkärnans periferi. Dock kan det finnas aktiva gener i områden i direkt anslutning till de porer som penetrerar cellkärnans periferi. Relationen mellan arvsmassans organisation i cellkärnan och geners uttrycksnivå är för närvarande oklar. Vår intention är att utveckla tekniker för undersökningar av detta samband i levande celler. Teknikerna skall möjliggöra 3-dimensionella uppskattningar av omorganisering av arvsmassan på global nivå till följd av förändringar i genuttryck. Den ena metoden bygger på framställning speciella sensormolekyler placerade på strategiska ställen i cellkärnan och som känner av omorganisation av arvsmassan och "rapporterar" detta genom förändrad fluorescens signalering. Den andra metoden baseras på relativ anrikning av en specifik markör för aktiva gener lokalt i cellkärnan. Med båda metoderna planerar vi att studera förändrad organisation av arvsmassan till följd av differentiering av stamceller eller i celler med genetiska sjukdomsdefekter hos proteiner i cellkärnans periferi. I en annan del av projektet försöker vi avhjälpa bristen på metoder för kvantifiering av parametrar som beskriver interaktionen mellan två proteiner inne i en levande cell, något som efterfrågas av den nya "kvantitativa biologin" där man skapar virtuella modeller av hur celler fungerar. Existerande in vitro metoder, kan inte mäta bindningsparametrar under biologiskt relevanta betingelser, som tar hänsyn till lokalt pH, jonstyrka och är "blinda" för tillfälliga modifieringar av proteiner som sker i levande celler. Vi har funnit det teoretiskt möjligt att mäta dessa parametrar i levande celler med hjälp av mikroskopisk kvantifiering av distributionen av proteiner i fri respektive bunden form i ett givet ögonblick. Vi har klara indikationer på att resonemanget är korrekt och är nu i färd med att bevisa vår tes. Vi ser särskilt fram emot situationer där interaktionen mellan två proteiner i levande celler skiljer sig från interaktionen som kan uppmätas in vitro. De av oss föreslagna studierna förväntas öka förståelsen av levande cellers dynamiska processer och möjliggöra fastställande av proteiner bindningsegenskaper under fysiologiska betingelser. Vi förväntar oss att våra undersökningar kommer att resultera i nya rationella automatiserade metoder för global övervakning av cellulära processer som lämpar sig mycket väl för screening inom bioteknisk och läkemedels industri.


External Partners


Last updated on 2017-24-03 at 13:00

Share link